CD40/CD40L系统在脑梗塞疾病发生发展中的作用及机制研究

【摘要】研究背景：脑梗塞(cerebralinfarction,CI)又名缺血性脑卒中,主要是由于脑动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和血栓形成,使管腔狭窄甚至闭塞,导致急性局灶性脑供血不足而引起的疾病。CI发病率高、死亡率高,并呈逐年上升趋势,严重危害人类健康。大量证据表明AS是CI的主要病理基础。多种分子和信号途径参与了CI的病理生理过程。CD40/CD40L信号参与调控免疫、炎症、氧化应激、高凝等多种病理生理状态,在AS发生、发展以及斑块破裂诸多环节中发挥重要作用。国内外大量的研究已经证实,CI是遗传因素与环境因素共同作用所导致的多基因疾病,多种基因的遗传多态性与CI的发生发展密切相关。近年来研究发现,编码合成人类CD40的基因也存在单个核苷酸序列多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP),这些功能性SNP可以通过改变CD40的表达和活性,引起下游生物学效应的相应变化,从而影响包括CI在内的一系列自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生发展。目的：通过病例-对照研究,阐明CD40基因多态性与汉族人群CI遗传易感性关联关系,为CI形成的机制提供新的实验证据,并为寻找CI防治药物提供新思路。方法：收集CI患者及健康对照者血液标本并提取外周血DNA,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对所有病例和正常对照组人群CD40rs1883832(C/T)多态性进行基因分型；ELISA试剂盒检测正常组和病例组三种基因型个体血浆sCD40L水平；实时荧光定量PCR测定CI患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CD40mRNA表达；χ2检验比较病例和对照人群CD40rsl883832(C/T)基因型分布的异同；非条件Logistic回归分析确定CD40rs1883832(C/T)多态性对CI易感性的影响；单因素方差分析(ANOVA)比较不同基因型个体血浆sCD40L水平和不同基因型个体PBMCs户CD40表达水平。结果：1、785例健康对照人群中rs1883832多态性位点CC、CT和TT基因型分布频率分别为35.4%、48.4%和16.2%；473例CI患者中CD40rs1883832(C/T)多态性位点CC、CT和TT基因型分布频率分别为28.1%、53.5%和18.4%,病例和对照人群中该位点基因型分布均符合Hardy-Wenberg平衡,CI病例组和对照组问CD40rsl883832多态性位点三种基因型分布具有显著差异,P值为0.028。通过对性别、年龄及CI病因分层分析发现：1)较正常对照组男性,病例组男性CC基因型频率显著降低(P=0.013)；2)在50岁以上人群中,CI患者较同年龄层健康对照人群CD40rs1883832CC基因型分布频率显著降低(P=0.006)；3)与对照组比较,腔隙梗死性CI患者CC基因型分布频率显著降低(P=0.028)。2、CD40rs1883832多态性位点基因型为TT和CT的男性CI患者血浆sCD40L水平较CC基因型个体显著升高(P<0.05)。3、CD40rs1883832多态性位点TT基因型个体PBMCs中CD40mRNA表达水平显著高于该位点CC、CT基因型个体(P<0.05)。结论：1)CD40rs1883832(C/T)多态性位点与汉族人群CI易感性相关,携带该位点T等位基因可增加汉族人群CI的发病风险；2)CD40rs1883832多态性位点T等位为危险等位基因。研究背景：脑梗塞(cerebralinfarction,CI),是一类严重危害人类健康的脑血管疾病,主要由动脉粥样硬化引起,以脑组织发生缺血、缺氧、坏死而引起的神经功能障碍为主要临床表现。血管内皮细胞是血管组成的重要细胞之一,合成和释放多种血管活性因子,在脑血管病的自身调节中发挥重要作用,血管内皮损伤是多种心血管疾病的始动因素。内皮细胞上表达有CD40蛋白,CD40活化后可激活包括核转录因子NF-κB在内的下游信号通道,上调促炎和促血栓基因的表达,进而影响内皮及循环功能。姜黄素(curcumin)是从植物姜黄中提取的一种黄色酸性酚类物质,是姜黄发挥药理作用的主要活性成分。姜黄素可多途径抑制核转录因子NF-κB的激活,下调包括多种NF-κB下游基因的表达,发挥抗氧化、抗炎、抗增殖等多种药理学效应。目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、同型半胱氨酸(Hcy)诱导的血管内皮损伤中CD40的表达变化,以及姜黄素对血管内皮损伤的保护作用是否通过抑制CD40信号通路所介导。方法：AngⅡ造模实验分设正常对照组、AngⅡ损伤模型组(AngⅡ10-5M)、AngⅡ损伤与姜黄素低中高剂量(10-6M、3×10-6M、10-5M)共同作用组、阳性药物组(AngⅡ10-5M+替米沙坦10-5M)。Hcy造模实验分设正常对照组、Hcy损伤模型组(Hcy10-3M)、Hcy损伤与姜黄素低中高剂量(10-6M)、3×10-6M、10-5M)共同作用组、阳性药物组(瑞舒伐他汀10-5M)。Hoechst33258染色检测细胞凋亡；Real-timePCR检测HUVEC-C细胞中CD40mRNA表达水平；WesternBlot检测HUVEC-C细胞中CD40蛋白表达水平。结果：1、AngⅡ可显著上调HUVEC-C内皮细胞中CD40mRNA的表达,与正常组比较,差异具有显著性(P<0.05)；不同浓度姜黄素预处理能抑制AngⅡ所致CD40mRNA的上调,且姜黄素高浓度组能显著抑制AngⅡ所致CD40mRNA的上调(P<0.05)；2、AngⅡ能明显上调CD40蛋白表达,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；高浓度姜黄素预处理能显著抑制AngⅡ所致CD40蛋白表达的上调,与AngⅡ组比较具有显著性差异(P<0.05)；3、Hcy可显著上调HUVEC-C细胞中CD40mRNA的表达,与正常组比较,差异具有显著性(P<0.05),不同浓度姜黄素预处理可抑制Hcy所致CD40mRNA的上调,高浓度姜黄素可显著抑制Hcy所致CD40mRNA的上调(P<0.05)；4、Hcy能明显上调CD40蛋白表达,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)；高浓度姜黄素预处理能显著抑制Hcy所致CD40蛋白表达的上调(P<0.05)。结论：姜黄素可下调AngⅡ、Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-C)CD40mRNA和蛋白表达的增加,对AngⅡ、Hcy诱导的内皮损伤起保护作用。研究背景：CD40/CD40L信号通路是T细胞活化的重要辅助刺激通路,不仅在调节T细胞免疫反应中起关键作用,而且也在B细胞的活化、增殖、分化、抗体的分泌中起重要作用。CD40/CD40L系统通过外周血单个核细胞(PBMCs)介导的炎症免疫反应可能参与了AS斑块的发生、发展、破裂和血栓的形成。CD40rs1883832位点能够通过改变CD40/CD40L系统的水平而影响心、脑血管疾病的发生发展。原代PBMCs可以进行基因分型,是考察CD40rs1883832基因多态性对损伤及药物反应性差异研究的最佳细胞模型。目的：培养CD40rsl883832SNP位点不同基因型个体原代PBMCs,研究Hcy损伤以及姜黄素对CD40不同基因型个体PBMCs中CD40表达的影响,以探讨Hcy的损伤作用以及姜黄素的治疗作用与CD40基因多态性之间是否存在关联。方法：收集健康志愿者外周血30mL,提取外周血基因组DNA,并进行基因分型,同时分离提取外周血PBMCs,培养后分为溶媒组,Hcy造模组、Hcy损伤与1×10-5mol/L姜黄素共同作用组、瑞舒他汀(阳性药物)组进行预处理,Real-timePCR检测PBMCs中CD40mRNA表达水平；WesternBlot检测PBMCs中CD40蛋白表达水平。结果：1、10-3MHcy处理PBMCs24h后,携带CD40rs1883832T等位的PBMCsCD40mRNA的表达水平增加3倍,携带T等位的PBMCsCD40mRNA的表达水平是CC基因型的2倍；2、10-3MHcy显著上调CD40蛋白的表达,携带CD40rs1883832T等位的PBMCsCD40蛋白上升程度显著高于未携带T等位个体；3、姜黄素和瑞舒伐他汀可阻断Hcy诱导的CD40水平的升高,携带CD40rs1883832T等位的PBMCs对这种姜黄素和瑞舒伐他汀保护作用更为敏感。结论：携带T等位的PBMCs在接受Hcy处理后表现出更为显著的损伤效果,携带CD40rs1883832T等位的PBMCs对姜黄素的保护作用更为敏感。
【作者】张毕奎；
【导师】李焕德；
【作者基本信息】中南大学，药理学，2013，博士
【关键词】脑梗塞；CD40；单核苷酸多态性；遗传易感性；可溶性CD40L；人脐静脉内皮细胞株；血管紧张素Ⅱ；同型半胱氨酸；姜黄素；内皮损伤；Hcy；PBMCs；

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